2021年12月15日，中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室冯有智研究员团队应用长光辰英核心产品-PRECI SCS单细胞分选仪在《European Journal of Soil Science》杂志上发表了题为“Coupled magnetic nanoparticle-mediated isolation and single-cell image recognition to detect Bacillus’ body size in soil”的论文，文章第一作者为荣楠博士，该文章应用磁性纳米颗粒介导分离(MMI)技术和单细胞图像识别(SCIR)技术，将微生物的形态研究从复杂环境扩展到单细胞水平。

一、研究背景

微生物形态从根本上限制了物种与环境的相互作用，从而最终影响其生态位。土壤环境的复杂性和土壤微生物种类的多样性阻碍了我们从中分离并观测单一活性群落。本实验结合了磁性纳米颗粒介导分离(MMI)技术和单细胞图像识别(SCIR)技术，探究土壤活性芽孢杆菌在施用有机肥(OF)、无机肥(MF)和未施肥(CK)处理中的群落组成与形态变化。结果表明，MMI结合SCIR技术能有效地从土壤颗粒和其他微生物中分离并观测活性芽孢杆菌。具体而言，不同施肥处理土壤中活性芽孢杆菌群落结构相似，而OF处理中活性芽孢杆菌的数量及细胞大小均高于与MF和CK处理。综上所述，MMI和SCIR技术的结合是分离土壤生态系统中活性功能微生物并观测其形态的有力工具。

二、研究成果

1. 最佳分离效率：为保证初始土壤悬浮液中所有微生物细胞和土壤颗粒刚好被磁性纳米粒子（MNPs）包裹且具备磁性，即土壤磁性功能化效率曲线拐点，对于相同量的土壤悬液，MF与CK处理悬液需要1.2 g MNPs，而OF处理悬液则需要1.6 g MNPs (图1A)。如图1B所示，按上述比例混合土壤悬液与MNPs，再用磁铁吸附磁性材料包裹的微生物后，剩余部分均澄清透明，这再次佐证了土壤悬液与MNPs的最佳比例。

图1: 三种施肥处理下土壤悬浮液与MNPs的最佳配比

2.  使用MMI方法减少背景值。与密度梯度离心法(图2A)相比，MMI处理后视野内几乎再无大块杂质(图2B)，且因经过培养而富集了芽孢杆菌，使得裸露的单细胞数量增加。处理后的菌悬液直接用于DNA提取及后续测序分析。

图2：使用MMI方法减少背景值。

3. 不同施肥条件下芽孢杆菌的不同组成。根据SILVA数据库进行分类，在CK、MF和OF施肥处理土壤中筛选到的细菌中分别有71%、74%和78%来自芽孢杆菌(图3A)。这一结果表明，MMI是一种可以从复杂的微生物群落(如土壤)中分离活性功能物生物强大的工具。

基于Bray-Curtis距离的NMDS分析(图3B)和PERMANOVA（表2）结果证实，三种施肥制度下芽孢杆菌的群落结构没有显著差异(P ＞0.05)。

图3：相对丰度分析（A）和NMDS分析（B）。

表2：不同施肥处理下活性芽孢杆菌群落结构差异

为明确不同施肥处理对土壤芽孢杆菌细胞大小的影响，绘制了OF、MF和CK处理下芽孢杆菌细胞大小的箱型图 (图4A)与频率分布图 (图4B)。结果显示，芽孢杆菌细胞大小呈现OF > CK >MF的趋势，且均有显著差异（P＜0.05）。OF与CK处理下的细胞面积主要在5-10 μm2区间内，而MF处理下的细胞面积则主要在0-5 μm2区间内。只有OF与CK处理下存在细胞大小在15-25 μm2区间内的细胞，且OF处理下的细胞数量更多；而仅有OF处理下存在细胞大小在25-30 μm2区间内的细胞。

图4：3种施肥条件下土壤芽孢杆菌大小的箱线图(A)和频数分布图(B)。

三、讨论

微生物形态是微生物的一个关键生态特性，它决定了许多生活史属性，如营养物质获取效率。然而，我们仍缺乏对土壤环境变化如何影响细胞大小的了解。本研究采用MMI结合SCIR技术研究三种施肥条件下具有代谢活性的土壤芽孢杆菌的细胞大小。

1.利用MMI结合SCIR技术观察和分离活性芽孢杆菌 

土壤颗粒和土壤有机质与物生物结合紧密，难以分离。如图2A(土壤悬液经密度梯度离心处理)所示，微生物细胞分散在土壤颗粒大背景下，因此视野内看不到单个细胞。这使得在原位观察土壤微生物的形态十分困难。而MMI方法的发展使之成为可能。如图2B(土壤悬液经MMI技术处理)所示，我们可以清楚地看到杆状细菌。为了达到该结果，我们首先使用高温灭活阻止非目标菌的生长分裂，然后培养目标菌一天。虽然一天的培养可能会在一定程度上轻微改变细胞大小和微生物群落，但它保证了活性芽孢杆菌的生长与脱去磁性从而保证成功分离。在这项研究中，我们证明了MMI和SCIR的结合可以用于观察来自复杂环境(如土壤)的活的功能细胞的形态，并且这些细胞可以用于进一步的生态生理学研究，从而有利于下游分析与微生物形态的整合。该方法也可用于观察其他复杂环境中功能微生物的形态，例如用污染物做唯一碳源。

2. 有机施肥对活性芽孢杆菌大小的刺激作用

微生物的大小可以反映其利用生存环境中的资源的能力。Sargent等人发现，在富营养培养基上生长的枯草芽孢杆菌细胞长度是在寡营养培养基上生长细胞的两倍。我们的研究结果也发现OF处理显著增加了芽孢杆菌的大小(图4A)。造成该结果的原因可能有两个。一是不同的施肥处理并未改变芽孢杆菌的群落结构，只改变了芽孢杆菌的细胞大小。二是不同施肥处理改变了芽孢杆菌的群落结构，进而筛选出不同大小的芽孢杆菌。根据测序结果我们发现活性芽孢杆菌的群落结构未有显著变化，因此可推断原因为前者。

四、结论

本研究表明，MMI法和SCIR法相结合可用于探究土壤活性芽孢杆菌的细胞大小和群落组成。具体而言，我们采用上述方法对三种典型的长期施肥土壤样品进行了分析，发现有机施肥促进了土壤活性芽孢杆菌的丰度和大小。这些结果为了解长期不同施肥对碱性土壤活性微生物的影响提供了有用的信息，并为在单细胞层面探究细胞形态提供了方法。

原文连接：

https://bsssjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/ejss.13236